Американські дослідники показали, що додавання невеликого елемента вторинної структури до напрямної РНК може істотно збільшити точність редагування ДНК CRISPR-системами. Як пояснюють вчені в статті в, РНК-шпилька заважає нуклеазній активності Cas-білка на «неправильних» мішенях, але не заважає в разі точної відповідності послідовностей між напрямною РНК і мішенню.
Незважаючи на значний прорив в області терапевтичного застосування CRISPR-редагування (ці системи вже застосовують для редагування генома окремих клітин, наприклад, лейкоцитів, і навіть редагування ембріонів людини), вчених як і раніше турбує точність роботи CRISPR, яка нерідко проявляє нецільову активність в людському геномі. Збільшити точність впізнавання і розрізання ДНК найчастіше намагаються шляхом внесення мутацій в CRISPR-ефектори, зокрема, білок Cas9. Тим не менш, такий підхід, хоч і призвів до створення безлічі варіантів Cas зі збільшеною специфічністю, найчастіше призводить і до істотного зниження ефективності редагування на потрібних мішенях.
Вчені з університету Дьюка підійшли до проблеми з іншого боку і зайнялися налаштуванням РНК-компонента CRISPR. «Спрощений» варіант CRISPR-системи, який використовують як інструмент редагування в еукаріотичних клітинах, включає ефектор (Cas9 або Cas12a) і направляючу РНК, яка містить 20-нуклеотидний спейсер - ділянку, комплементарну послідовності в геномі, яку потрібно порізати. Відомо, що в точність впізнавання основний внесок робить перша частина спейсера. Дослідники припустили, що якщо кінець сховати всередині вторинної структури, точність редагування збільшиться.
Щоб перевірити гіпотезу, автори роботи передбачили і показали експериментально, що додавання короткої послідовності, що утворює з 5 "-концем РНК-спейсера невелику і не дуже міцну шпильку, не знижує ефективності зв'язування Cas9 з мішенню, але при цьому впливає на ефективність редагування. Останній параметр перевіряли на направляючих РНК проти генів VEGFA і EMX1, у яких є по кілька відомих «оф-таргетів» (ділянок неспецифічного зв'язування в геномі).
Виявилося, що для таких ділянок шпилька значно знижує небажану активність - як порівняно з контрольним немодифікованим спейсером, так і порівняно з укороченим варіантом спейсера, де зайві літери просто відрізали, і порівняно зі спейсером з довіскою, що не утворює шпильки. На потрібній ділянці активність CRISPR при цьому істотно не змінювалася (хоча обчислення передбачали її зниження). В середньому для ряду оф-таргетів збільшення точності «канонічного» SpCas9 з сталося в 55 разів. Збільшення точності в присутності шпильки автори також побачили для інших використовуваних на практиці ефекторів - SaCas9 з і різних форм Cas12a.
Обговорюючи механізм спостережуваного феномену, автори роботи припустили, що шпилька на кінці спейсера інгібує формування комплексу РНК-ДНК (так званої R-петлі), яке необхідне для нуклеазної активності Cas-білка, в разі неточного спарювання ДНК-РНК, і таким чином, оберігає систему від нецільової активності. Найголовніше в такому способі збільшення специфічності - його універсальність, оскільки напрямна РНК використовується всіма CRISPR-системами, і її просто синтезувати.
Подивитися своїми очима, як працює CRISPR-Cas9 в клітці, можна тут.